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本生ELISA實(shí)驗(yàn)技巧:酶標(biāo)板分類與性能判斷

更新時(shí)間:2022-12-27    點(diǎn)擊次數(shù):2351

  本生ELISA實(shí)驗(yàn)技巧:酶標(biāo)板分類與性能判斷


  本生酶標(biāo)板作為ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的輔材,起著舉足輕重的作用并直接影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果,酶標(biāo)板的好壞主要取決于其對(duì)蛋白吸附的靈敏度、板孔間蛋白吸附能力差異以及所采購(gòu)酶標(biāo)板批次間的差異。因此,選擇一款蛋白吸附靈敏度高、對(duì)蛋白吸附能力孔間差異小、批次間差異小的酶標(biāo)板產(chǎn)品,是實(shí)驗(yàn)者獲得可靠、穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保障。

  

酶標(biāo)板


  本生酶標(biāo)板分類:根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn),酶標(biāo)板有著不同的分類。

  一、根據(jù)孔數(shù),可分為96孔、48孔等,由于酶標(biāo)板主要是配合酶標(biāo)儀用,目前市面上的酶標(biāo)儀最多為96孔,因此酶標(biāo)板最為常用的也是96孔。

  二、根據(jù)其底部的不同,又分為平底的,U型底、V型底等。平底的折射率低,適于在酶標(biāo)儀檢測(cè);U型底的酶標(biāo)板折射率較高,方便加樣、吸樣、混勻等操作,可以不用放在酶標(biāo)儀上,直接通過(guò)目測(cè)觀察顏色變化情況,從而判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)。V底的酶標(biāo)板可以精確的吸取樣品。

  三、根據(jù)酶標(biāo)板與蛋白和其它分子結(jié)合能力的不同,又分為高結(jié)合力、中結(jié)合力和氨基化等。

  1) 高結(jié)合力

  此種酶標(biāo)板,表面經(jīng)處理后,其蛋白結(jié)合能力大大增強(qiáng),可達(dá)300~400ng IgG/cm2,主要結(jié)合的蛋白分子量>10kD。使用該類酶標(biāo)板可提高敏感性,并可相對(duì)減少包被蛋白的濃度和用量,不足之處為較易產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。抗原或抗體包被后,以非離子去污劑無(wú)法有效地封閉未結(jié)合蛋白的部位,需使用蛋白作為封閉劑。

  (2) 中結(jié)合力

  此類酶標(biāo)板經(jīng)表面疏水鍵被動(dòng)與蛋白結(jié)合,適合作為分子量>20kD的大分子蛋白的固相載體,其蛋白結(jié)合能力為200~300ng IgG/cm2。由于該類酶標(biāo)板所具有的僅與大分子結(jié)合的特性,適用于作為未純化抗體或抗原的固相載體,可降低潛在的非特異性交叉反應(yīng)。該類板可以惰性蛋白或非離子去污劑作為封閉液。

  (3)氨基化

  這種酶標(biāo)板經(jīng)表面改性處理后擁有帶正電荷的氨基,其疏水鍵由親水鍵取代。該類酶標(biāo)板適合作為小分子蛋白的固相載體。使用合適的緩沖液和pH值,其表面可通過(guò)離子鍵與帶負(fù)電荷的小分子結(jié)合。由于其表面的親水特性和可通過(guò)其它交聯(lián)劑共價(jià)結(jié)合的能力,可用于固定溶于Triton-100、Tween 20等去污劑的蛋白分子。該類板的缺陷為由于降低了疏水性,一部分蛋白分子無(wú)法結(jié)合;此外,其表面需有效地封閉。由于親水和共價(jià)的表面特性,使用的封閉液必須能夠與非反應(yīng)性氨基基團(tuán)和所選擇的交聯(lián)劑中任何功能基團(tuán)發(fā)生作用。

  四、根據(jù)顏色可分為透明、黑色、白色。

  透明的是常用的,用于最一般的酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)。相對(duì)于透明的的酶標(biāo)板,還有用于發(fā)光檢測(cè)用的不透明的酶標(biāo)板,一般有黑色和白色兩種。黑色的酶標(biāo)板自身會(huì)有光吸收,所以它的信號(hào)相對(duì)于白色酶標(biāo)板要低很多,因此一般用于檢測(cè)較強(qiáng)的光,如熒光檢測(cè)。而白色的酶標(biāo)板就用于較弱的光檢測(cè),常用于一般的化學(xué)發(fā)光。另外黑色的酶標(biāo)板還可以消弱非特異反應(yīng)帶來(lái)的問題。同時(shí)需要注意的是,用一般的酶標(biāo)板不可以進(jìn)行發(fā)光檢測(cè),因?yàn)橐话銖幕瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)中發(fā)射出的光是各向同性,如果用透明的酶標(biāo)板,光不僅會(huì)從垂直方向發(fā)散,還會(huì)從水平方向發(fā)散,使得光極易通過(guò)各個(gè)孔之間的間隙和孔壁,從而導(dǎo)致各孔的光吸收值受到相鄰孔發(fā)射光的影響。

  天津本生 酶標(biāo)板性能判斷

  良好的酶標(biāo)板應(yīng)該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間、同一板各孔之間性能相近。酶標(biāo)板由于原料的不同和制作工藝的差別,各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,因此,每一批號(hào)的酶標(biāo)板在使用前須事先檢查其性能。

  常用的檢查方法為:以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔,洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體,保溫后洗滌,加底物顯色,終止酶反應(yīng)后,分別測(cè)每孔溶液的吸光度。控制反應(yīng)條件,使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計(jì)算全部讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差,應(yīng)小于10%。以下以A、B、C三款酶標(biāo)板為例。

  


  直接法:檢測(cè)Human IgG在酶標(biāo)板表面的吸附

  


  雙抗體夾心法:包被山羊抗人抗體檢測(cè)陽(yáng)性血清中抗原

  

酶標(biāo)板實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)


  由上圖可以看出,這三類本生酶標(biāo)板中,A類酶標(biāo)板具有更好的蛋白吸附效果,同時(shí)也提高蛋白吸附的靈敏度,能夠提供更為可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

  另外,可以詢問酶標(biāo)板的批內(nèi)差異,以下是某款酶標(biāo)板的批內(nèi)差異。

  由批內(nèi)差異數(shù)據(jù)圖可以看出,該酶標(biāo)板具有很好地批間穩(wěn)定性,批內(nèi)變異系數(shù)(CV)差異均在5.0%附近,明顯低于業(yè)內(nèi)關(guān)于臨床免疫反應(yīng)用酶標(biāo)板的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中批內(nèi)變異系數(shù)低于10.0%的要求,因此也適合用于ELISA實(shí)驗(yàn)。


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